限制性內(nèi)切酶綜述及分類指南

發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶
      40 年前，當(dāng)人們研究細(xì)菌對抗噬菌體宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。人們普通認(rèn)為，限制性內(nèi)切酶能保護(hù)細(xì)菌不受噬菌體的感染，行使微生物免疫功能。缺乏限制性內(nèi)切酶的 E. coli  菌株極易被噬菌體感染，但如果這類細(xì)菌體內(nèi)存在限制性內(nèi)切酶，被成功感染的機(jī)率就會明顯降低。擁有的限制性內(nèi)切酶種類越多，保護(hù)作用也就越強(qiáng)；一種擁有四、五種不同限制性內(nèi)切酶的細(xì)胞就幾乎不受感染。
      *被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶包括來源于大腸桿菌的 EcoRI 和 EcoRII，以及來源于流感嗜血桿菌的 HindII 和 HindIII。
      這些酶可在特定位點(diǎn)切開 DNA，產(chǎn)生可體外連接的 DNA 片段。不久，研究者就發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因的組成、功能及表達(dá)非常有用的工具。
當(dāng)限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用在二十世紀(jì) 70 年代末開始流傳時，以 NEB 為代表的許多公司開始尋找更多的限制性內(nèi)切酶。除了某些病毒以外，限制性內(nèi)切酶僅在原核生物中被發(fā)現(xiàn)。如今，人們已經(jīng)從數(shù)以千計的細(xì)菌及古細(xì)菌中尋找過限制性內(nèi)切酶。
      原核基因組序列分析數(shù)據(jù)表明，限制性內(nèi)切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的細(xì)菌和古細(xì)菌似乎都能編碼限制性內(nèi)切酶。
 

      限制性內(nèi)切酶的形式多樣，小到如 157 個氨基酸的 PvuII，大者甚于 1,250 個氨基酸的 CjeI。在已純化分類的 3,000 多種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn) 250多種不同序列特異性的內(nèi)切酶，其中超過 30% 是由 NEB 發(fā)現(xiàn)并深入研究的。人們不僅從生化角度分析細(xì)胞提取物，也采用計算機(jī)分析已知的基因組數(shù)據(jù)，以期能發(fā)現(xiàn)更多的識別未知特異序列的限制性內(nèi)切酶。
盡管很多新發(fā)現(xiàn)的酶的識別序列與已有的一致，即同裂酶，但仍然有許多識別新位點(diǎn)的酶在不斷被發(fā)現(xiàn)。
       二十世紀(jì) 80 年代初，NEB 開始克隆并表達(dá)限制性內(nèi)切酶。克隆技術(shù)將限制性內(nèi)切酶的表達(dá)與原有細(xì)胞環(huán)境分離開來，避免了原細(xì)胞中其它內(nèi)切酶的污染，提高了酶的純度。此外，克隆技術(shù)能提高限制性內(nèi)切酶的產(chǎn)量，簡化純化過程；而且克隆的基因易于測序分析，其表達(dá)蛋白可進(jìn)行 X- 射線晶體結(jié)構(gòu)分析，有利于進(jìn)一步鑒定克隆產(chǎn)物。
限制-修飾（R-M）系統(tǒng)
      大多數(shù)限制性內(nèi)切酶常常伴隨有一、兩種修飾酶（甲基化酶），后者能保護(hù)細(xì)胞自身的 DNA 不被限制性內(nèi)切酶破壞。修飾酶識別的位點(diǎn)與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶相同，它們的作用是甲基化每條鏈中的一個堿基，而不是切開 DNA 鏈。甲基化所形成的甲基基團(tuán)能伸入到限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的雙螺旋大溝中，阻礙限制性內(nèi)切酶發(fā)揮作用。這樣，限制性內(nèi)切酶和它的“搭檔”修飾酶一起組成 R-M 系統(tǒng)。在某些 R-M 系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨(dú)立行使自己的功能；另一些 R-M 系統(tǒng)本身就是一種大的限制-修飾復(fù)合酶，由不同亞基或同一亞基的不同結(jié)構(gòu)域來分別執(zhí)行限制或修飾功能。

限制性內(nèi)切酶分類
      按照亞基組成、酶切位置、識別位點(diǎn)和輔助因子等不同，傳統(tǒng)上將限制性內(nèi)切酶分為四大類。然而，蛋白測序的結(jié)果表明，限制性內(nèi)切酶的變化多種多樣，若從分子水平上分類，則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止四類。

Ⅰ型限制性內(nèi)切酶是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多亞基蛋白復(fù)合體。它們可在遠(yuǎn)離識別位點(diǎn)處任意切割 DNA 鏈。
      以前認(rèn)為Ⅰ型限制性內(nèi)切酶很稀有，但基因組測序分析發(fā)現(xiàn)這類酶其實很常見。盡管Ⅰ型酶在生化研究中很有意義，但其不能產(chǎn)生確定的限制片段和明確的凝膠電泳條帶，因而不具備實用性。

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶能在其識別序列內(nèi)部或附近特異地切開 DNA 鏈。它們產(chǎn)生確定的限制性片段和凝膠電泳條帶，因此是*一類用于 DNA分析和克隆的限制性內(nèi)切酶。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來源都不盡相同的蛋白組成，因而它們的氨基酸序列可能截然不同。如今看來，這些酶很可能是在進(jìn)化過程中獨(dú)立產(chǎn)生的，而非來源于同一個祖先。
      zui常見的 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶在特異性識別序列內(nèi)部切割 DNA，如 HhaI、HindIII 和 NotI，商業(yè)化酶多屬此類。它們一般以同源二聚體的形式結(jié)合到 DNA 上，識別對稱序列；但也有少量的酶與DNA 結(jié)合形成異二聚體，識別非對稱序列（如BbvCI 識別 CCTCAGC）。一些酶識別連續(xù)性序列（如 EcoRI 識別 GAATTC，其中的兩個半識別序列是相連的）；而另一些識別非連續(xù)性序列（如 BglI 識別GCCNNNNNGGC，其中的兩個半識別序列是不相連的）。限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生一個 3' -羥基和一個 5' -磷酸基。只有當(dāng)鎂離子存在時，它們才有切割活性，相應(yīng)的修飾酶則需要 S- 腺苷甲硫氨酸的存在。這些酶一般都比較小，亞基約 200-350 個氨基酸。

另一種比較常見的 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶是所謂的ⅡS 型酶，如 FokI 和 AlwI，它們在識別位點(diǎn)之外切開 DNA。這些酶大小居中，約 400-650 個氨基酸，由 DNA 結(jié)合域和切割 DNA 的功能域組成。它們識別連續(xù)的非對稱序列。一般認(rèn)為這些酶主要以單體的形式結(jié)合到 DNA 上，與鄰近酶分子的切割功能域結(jié)合成二聚體，協(xié)同切開 DNA鏈。因此一些ⅡS 型酶在切割含有多個識別位點(diǎn)的 DNA 分子時活性更高。
第三種常見的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶是ⅡG 型限制性內(nèi)切酶，由限制酶和修飾酶聯(lián)合組成，分子量較大，通常由 850-1,250個氨基酸組成，在同一蛋白上表現(xiàn)有限制和修飾兩種活性。此類酶在其識別序列外進(jìn)行切割；那些識別連續(xù)性序列的 IIG 內(nèi)切酶、（如 AcuI 識別 CTGAAG）僅在識別位點(diǎn)的一端切割 DNA 鏈；而那些識別非連續(xù)性序列的 IIG 內(nèi)切酶（如 BglI識別 GCCNNNNNGGC），會在識別位點(diǎn)的兩端切割 DNA 鏈，產(chǎn)生一小段含識別序列的片段。這些酶的氨基酸序列各不相同，但其結(jié)構(gòu)組成是一致的，N 端為 DNA 切割和修飾域；C 端為一、兩個識別特異 DNA 序列的結(jié)構(gòu)域，該域也能以獨(dú)立的亞基形式存在。這些酶與底物結(jié)合時，它們或行使限制性內(nèi)切酶的功能切開底物，或作為修飾酶將其甲基化。

Ⅲ 型限制性內(nèi)切酶也是一類較大的兼有限制-修飾兩種功能的酶。它們在識別位點(diǎn)之外切開 DNA 鏈，并且要求同一 DNA分子中存在兩個反向的識別序列以完成切割。這類酶很少能達(dá)到*切割。
 

Ⅳ 型限制性內(nèi)切酶識別經(jīng)典甲基化的和修飾的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系統(tǒng)為代表。